Hits:

Indexed by:期刊论文

Date of Publication:2018-04-08

Journal:实用临床医药杂志

Volume:22

Issue:7

Page Number:1-6

ISSN No.:1672-2353

Key Words:细胞色素P4502C9(CYP2C9);CYP2C9*8;CYP2C9* 27;慢病毒;HEK293T

Abstract:目的 构建人细胞色素P450 2C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8与CYP2C9* 27的慢病毒表达质粒,并于HEK293T细胞中稳定表达.方法 反转录人肝总RNA获得cDNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,并克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9.以该质粒为模板,重叠PCR方法分别引入449G＞A与449G＞T点突变,并分别克隆至MigR1,获得MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9* 27慢病毒表达质粒.在HEK 293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9* 27的细胞,命名为293T-2C9、293T-2C9*8与293T-2C9* 27.实时定量PCR(qRT-PCR)与Western blot检测胞内CYP2C9表达.采用CYP2C9的特异性底物双氯芬酸对CYP2C9的活性进行评价.结果 成功构建MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9* 27表达载体.采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-2C9、293T-2C9 * 8与293T-2C9* 27在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100％,qRT-PCR与Western blot均表明有目标分子表达.提取自这三株细胞的微粒体均可催化双氯芬酸代谢为4-羟基双氯芬酸.结论 成功构建稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9* 27人源化细胞模型,该方法构建的细胞可用于CYP2C9*8与*27两个突变体的功能研究.