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论文类型：期刊论文

发表时间：2017-11-15

发表刊物：中国生物工程杂志

收录刊物：CSCD

卷号：37

期号：11

页面范围：52-58

ISSN号：1671-8135

关键字：金黄色葡萄球菌;ArlSCA;蛋白质纯化;激酶活性

摘要：金黄色葡萄球菌是一类重要的病原菌,其毒力因子的表达及分泌过程由多种双组分信号转导系统(two component signal transduction system,TCSTS)共同调控,其中ArlRS双组分信号转导系统与细菌的生长和分裂密切相关.ArlRS双组份系统的信号传递通过组氨酸激酶ArlS磷酸化实现,ArlS的胞内域被认为是调控毒力因子表达的重要功能域,以ArlS蛋白的胞内域部分即ArlSCA为目标蛋白进行相关的活性研究.首先,构建pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重组质粒,对目的蛋白进行诱导表达.其次,利用金属离子螯合层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析方法对目的蛋白进行分离纯化,纯化后的ArlR蛋白纯度可达98％,产量约为25mg/L;纯化后的ArlS蛋白纯度可达90％,产量约为15mg/L.圆二色谱检测结果显示纯化后的目的蛋白有完整的二级结构,体外磷酸化结果显示,ArlS蛋白具有激酶活性,自磷酸化后可以将磷酸基团转移给反应调控蛋白ArlR.最后,利用定点突变的方法,构建了418位和420位氨基酸残基突变的表达载体pProEX-HTa-ArlSCAG418A和pProEX-HTa-ArlSCAG420A.ArlSCAG418A和ArlSCAG420A蛋白不具有激酶活性,说明418位和420位氨基酸残基在ArlS蛋白的自磷酸过程中起着关键作用.