Title of Paper:亚洲玉米螟两种漆酶基因OfLac1和OfLac2 cDNA的克隆及基因表达

Hits:

Date of Publication:2014-04-01

Journal:中国农业科学

Included Journals:PKU、ISTIC、CSCD

Volume:47

Issue:7

Page Number:1341-1350

ISSN No.:0578-1752

Key Words:亚洲玉米螟;漆酶;基因克隆;表达分析

Abstract:【目的】克隆亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）漆酶-1（OfLac1）和漆酶-2（OfLac2）基因；研究OfLac1和OfLac2在亚洲玉米螟不同发育阶段和不同组织中的表达特异性；分析蜕皮激素处理亚洲玉米螟后OfLac1和OfLac2基因表达量的变化；比较OfLac1和OfLac2表达模式的差别，推测其生理功能。【方法】根据已知的其他昆虫中Lac-1和Lac-2的保守氨基酸序列分别设计引物，以亚洲玉米螟白蛹时期提取的RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增OfLac1和OfLac2的保守区。然后根据所得的保守区片段分别设计基因特异性引物，采用RACE方法分别克隆OfLac1和OfLac2的3′和5′端序列，通过拼接获得OfLac1和OfLac2的基因全长。收集5龄第4天亚洲玉米螟的表皮、中肠、脂肪体、丝腺、气管、马氏管、精巢7种不同组织材料，通过半定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同组织中的基因表达模式。收集从卵到成虫29个不同生长发育时期的亚洲玉米螟作为材料，采用实时荧光定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同发育时期的基因表达水平。选取5龄第2天亚洲玉米螟幼虫进行蜕皮激素注射，分别在1、4、8、12和24 h后取样，利用实时荧光定量PCR研究OfLac1和OfLac2在蜕皮激素诱导下的基因表达水平。【结果】克隆获得亚洲玉米螟OfLac1和OfLac2的 cDNA序列。OfLac1全长3065 bp，其中5′非编码区222 bp，3′非编码区440 bp，开放阅读框2403 bp，共编码800个氨基酸，其编码的蛋白分子质量约为90.6 kD，理论等电点pI为5.34；OfLac2全长3405 bp，其中5′非编码区162 bp，3′非编码区960 bp，开放阅读框2283bp，共编码760个氨基酸，其编码的蛋白分子质量约为84.0 kD，理论等电点pI为6.43。通过SignalP分析发现，OfLac1在N端包含一个长为22个氨基酸的信号肽，OfLac2在N端包含一个长为23个氨基酸的信号肽，均为分泌蛋白质。基因表达模式分析表明，在发育过程中，OfLac1主要在成虫中表达，在其他发育时期表达量较低；OfLac2在每个幼虫龄期的末期表达水平上调，在幼虫化蛹过程中的预蛹期表达量最高；在不同组织中，OfLac1在马氏管和中肠中表达量最高，在气管和表皮中的表达量较低，在精巢、丝腺和脂肪体中几乎不表达；OfLac2在中肠和丝腺中表达量最高，在气管和表皮中的表达量较低，在精巢、马氏管和脂肪体中几乎检测不到表达。将蜕皮激素20E注射到亚洲玉米螟体内，OfLac1在注射24 h后表达量明显上调，OfLac2在注射12 h后表达量开始上调，在24 h后上调最明显。【结论】克隆得到亚洲玉米螟两种漆酶OfLac1和OfLac2的 cDNA 序列。两种漆酶基因的表达模式存在明显差别，但都受蜕皮激素的调控。OfLac2可能参与蜕皮过程表皮褐化。